周珊珊,  郭志剛,  吳佳易,  賴文巖,   屠燕

[摘要] ：目的　探討煙酸促進動脈粥樣硬化(AS)兔逆膽固醇轉運(RCT)的作用及其可能機制。方法　健康雄性新西蘭白兔12只,隨機均分為對照組(給予單純高脂飲食建立AS 模型) 及煙酸組[在高脂飲食基礎上,每日給予口服煙酸400mg/ (kg ·d) ]。6 周后,取兩組動物外周血單核細胞、腹腔巨噬細胞、腹部皮下脂肪細胞、肝細胞,流式細胞儀檢測ATP 結合盒轉運子A1 (ABCA1) 表達量,液相閃爍計數(shù)法檢測[3 H]膽固醇轉出率;酶法和免疫方法檢測兔血脂及主動脈組織、脂肪組織、肝組織的總膽固醇(TC) 、非高密度脂蛋白膽固醇(NHDL2C) 、高密度脂蛋白膽固醇(HDL2C) 、載脂蛋白A1(apoA1) 含量變化; Image2Pro Plus Version 610 圖像分析軟件對比測定兩組AS 斑塊面積。結果　與對照組相比,煙酸組TC、NHDL2C明顯下降,HDL2C、apoA1 明顯上升( P < 0101) ,單核細胞、巨噬細胞、脂肪細胞的ABCA1 表達量及膽固醇轉出率均明顯上升,而肝細胞ABCA1 表達量、膽固醇轉出率則明顯下降( P < 0101) ,主動脈、脂肪組織、肝組織中膽固醇含量明顯減少( P < 0101) ,AS 斑塊面積顯著減小( P< 0105) 。結論　煙酸能明顯改善血脂譜,增加外周細胞ABCA1 表達量及膽固醇轉出率,降低主動脈AS 面積及組織中膽固醇含量。巨噬細胞ABCA1 表達量可作為反映體內RCT 水平的間接指標。

[關鍵詞] 　動脈粥樣硬化;ATP 結合匣式轉運子;膽固醇;尼克酸

[中圖分類號] 　R97216 　[文獻標志碼] 　A 　[文章編號] 　057727402(2010) 0320256204

Mechanism of niacin in promoting the reverse cholesterol transport in atherosclerotic rabbits

ZHOU Shan2shan , GUO Zhi2gang3 , WU Jia2yi , LAI Wen2yan , TU Yan1 Department of Cardiology , Nanfang

Hospital , Southern Medical University , Guangzhou 510515 , China＊Corresponding author , E2mail : guozhigang126@1261com

[ Abstract] 　Objective 　To investigate the protective effect and possible anti2atherosclerotic mechanism of nicotinic acid on reversecholesterol transport (RCT) in atherosclerotic rabbits. Methods 　Twelve rabbits were randomly divided into two groups (6 each) : controlgroup (rabbits were fed with high cholesterol diet for 6 weeks) and niacin group [ rabbits were fed with high cholesterol diet supplementedwith 400mg/ (kg ·d) niacin for 6 weeks ]. After the different treatments for 6 weeks , ATP2binding cassette transporter 1 (ABCA1)expression in macrophages , adipocytes and hepatic cells were evaluated with flow cytometry , [3 H] cholesterol efflux rates were analyzedwith liquid scintillation counting. Total cholesterol ( TC) contents , non high2density lipoprotein cholesterol (NHDL2C) , high2densitylipoprotein cholesterol ( HDL2C) and apolipoprotein A1 (apoA1) in aorta , adipose and liver tissues were measured by enzymatic andimmunologic method. The atherosclerotic area in aorta was calculated by Image2Pro Plus Version 610 software. Results 　Compared withcontrol group , TC contents and NHDL2C decreased , but HDL2C and apoA1 increased in niacin group ( P< 0101) . ABCA1 expressions andcholesterol efflux rates in monocytes macrophages , adipocytes were higher , but ABCA1 expressions and cholesterol efflux rates werelower in hepatocytes in niacin group compared with control group ( P< 0101) . The cholesterol contents in aorta , adipose and liver tissuesdecreased in niacin group compared with control group ( P < 0101) . Aortic atherosclerotic area was significantly reduced in niacin group

compared with that in control group ( P < 0105) . Conclusions 　Niacin can significantly improve the lipid profile , up2regulate ABCA1expressions and cholesterol efflux of peritoneal cells , thus leads to decrease of the atherosclerosis area in aorta and cholesterol contents in tissues. ABCA1 expression in macrophages may be used as an indirect index of RCT in vivo.

[ Key words] 　atherosclerosis ; ATP2binding cassette transporters ; cholesterol ; niacin

　雖然他汀類藥物在動脈粥樣硬化(atherosclerosis ,AS)及冠心病(coronary artery disease ,CAD) 的防治中有重要作用,但目前其降脂效果并不十分理想。2005年在巴賽羅納舉行的“升高高密度脂蛋白膽固醇國際專題討論會”上,將升高高密度脂蛋白膽固醇(highdensity lipoprotein cholesterol ,HDL2C)防治AS 及CAD的作用提到了重要高度。高密度脂蛋白在逆膽固醇轉運(reverse cholesterol transport ,RCT) 機制中具有重要作用, 而ATP 結合的盒轉運子A1 (ATP2bindingcassette transporter A1 ,ABCA1)是升高HDL2C及增加RCT 的關鍵基因,動物實驗也為巨噬細胞ABCA1 的心血管保護作用提供了證據(jù)[1] 。煙酸是目前升高HDL2C最有效的藥物,具有全面而獨特的調脂作用,但研究資料相對較少,雖有文獻報道其可增加脂肪細胞膽固醇轉出率[2] ,但煙酸與ABCA1 之間的關系,尤其是煙酸抗AS 的機制研究仍較少。本實驗探討了煙酸對AS 兔RCT 的促進作用,以期為AS 的發(fā)生機制和治療提供新的依據(jù).

1 　材料與方法

1．1 　實驗動物及分組　健康雄性新西蘭白兔12 只,體重210 ±011kg ,購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心(合格證號:0025759) 。以1 %膽固醇、0105 %膽鹽、5 %豬油加入普通飼料內配制成高膽固醇飲食飼料。采用隨機數(shù)字表將12 只兔均分為對照組(給予單純高脂飲食建

立AS 兔模型)和煙酸組[在高脂飲食基礎上,每日給予口服煙酸400mg/ (kg ·d) ]。

1.2血脂含量的檢測　分別于實驗的0、6 周在空腹12h 狀態(tài)下抽取兔耳緣靜脈血,利用OlympusAU5421 型全自動生化分析儀測定總膽固醇(total cho2lesterol ,TC) 、HDL2C、低密度脂蛋白膽固醇(low densi2ty lipoprotein cholesterol ,LDL2C) 、極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein cholesterol ,VLDL2C) 水平,利用免疫比濁法通過752 型分光光度計測定載脂蛋白A1(apolipoprotein A1 ,apoA1)含量。

1．3 　LDL 的制備、氧化修飾及修飾程度測定　取正常人新鮮血200ml ( EDTA 抗凝) ,用KBr 調整密度至1130g/ ml ,4 ℃下50 000r/ min 離心5h ,使LDL 與血漿其他蛋白成分分離,收集LDL ,于PBS 平衡鹽溶液中透析48h ,超濾除菌后4 ℃保存。LDL 的氧化修飾采用硫酸銅方法,不含EDTA 的LDL (1mg/ ml)置于含5μmol/ml Cu2 + 的PBS 中,37 ℃溫育24h。修飾后的LDL 置于含200μmol/ ml EDTA 的PBS 中透析24h ,4 ℃保存。修飾程度測定采用硫代巴比妥酸反應法,以Lowrys 法測定蛋白濃度。

1．4 　細胞分離及流式細胞儀測定ABCA1 表達　實驗6 周后,按照標準方法分離純化兔單核細胞、腹腔巨噬細胞、腹部皮下脂肪細胞[3] 、肝細胞,調整細胞懸液濃度為2 ×105 / ml ,同時與小鼠抗人ABCA1 一抗(美國Santa Cruz Biotechnology 公司) 混合后置室溫60min ,PBS 洗滌2 次,加入PE 熒光標記的羊抗小鼠二抗(美國Proteintech 公司) ,室溫避光反應30min 后在流式細胞儀(美國BD 公司) 上檢測細胞表面AB2CA1 表達量,結果以每100 個檢測細胞中ABCA1 的平均含量表示。

1．5 　[3 H]膽固醇轉出率測定　參照文獻[3]方法,將收集到的腹腔巨噬細胞、脂肪細胞、肝細胞分別與DMEM(012 %BSA) 、[3 H]膽固醇(1μCi/ ml)及氧化修飾的低密度脂蛋白(Ox2LDL) (蛋白濃度30μg/ ml) 培養(yǎng)24h ,換液,以DMEM 培養(yǎng)液洗滌1 次后,加入DMEM培養(yǎng)液(012 %BSA)及apoA1(10μg/ ml ,Sigma 公司) ,培養(yǎng)6h 后收取培養(yǎng)液,利用液閃計數(shù)儀檢測細胞溶解物及細胞介質的[3 H]放射量。膽固醇轉出率用細胞介質中[3 H]膽固醇放射量占總放射量(細胞內+ 細胞介質)的百分比表示。

1．6 　主動脈、脂肪、肝臟組織脂質的萃取及膽固醇含量測定　6 周時處死動物,打開腹腔后取脂肪組織、肝組織、主動脈,按照文獻[4]的方法粉碎后,按照標準方法萃取膽固醇,最后利用酶法通過752 型分光光度計檢測組織膽固醇含量。

1．7 　AS 面積計算　6 周時處死動物,打開腹腔后取升主動脈至髂動脈分叉處血管,縱行剖開,以蘇丹Ⅳ染色顯示AS 病變區(qū)域,然后用數(shù)碼相機拍攝,輸入電腦,應用Image2Pro Plus Version 610 圖像分析軟件測量并計算AS 斑塊面積(紅色染色區(qū)域) 占血管內膜總面積的 ？

百分比。

1．8 　統(tǒng)計學處理　采用SPSS 1115 統(tǒng)計軟件包進行分析,所有計量資料均以.x ±s 表示,組間采用兩獨立樣本比較的t 檢驗并進行Person 相關性分析。P < 0105 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 　結　　果

2．1 　血脂變化　建模前兩組動物血脂水平差異無統(tǒng)計學意義( P > 0105) 。6 周后,煙酸組TC、非高密度脂蛋白膽固醇(NHDL2C ,為LDL2C 與VLDL2C 之和) 較對照組明顯下降( P < 0101) ,而HDL2C、apoA1 則明顯上升( P < 0101 ,表1) 。

表1 　兩組血脂水平的比較(.x ±s ,n = 6)

Tab1 1 　Comparison on serum lipid levels between control andniacingroups (.x ±s , n = 6

TC(mmol/ L)             1。40 ±0126     24。11 ±2。80     1。47 ±0。13      17。23 ±1。37(1)

HDL2C(mmol/ L)         0。52 ±0。07    2。29 ±0。87      0。58 ±0。10      4。45 ±1。13(1)

apoA1(g/ L)              0。54 ±0。12    0。98 ±0。08      0。64 ±0。02      1。21 ±0。06(1)

　注:與對照組比較, (1) P< 0。01

2．2 　單核細胞、巨噬細胞、脂肪細胞、肝細胞上ABCA1表達量的變化　6 周后,與對照組比較,煙酸組單核細胞、巨噬細胞、脂肪細胞表面的ABCA1 表達量明顯升高,而肝細胞表面的ABCA1 表達量明顯降低(表2) 。

2．3 　兩組不同組織細胞膽固醇轉出率的比較　6 周后,煙酸組巨噬細胞、脂肪細胞膽固醇轉出率(分別為3.56 ±0.29、4.19 ±0135) 與對照組(分別為2152 ±0.34、3.09 ±0.08) 相比明顯上升( t = 14.747 , P < 0.01 ;t = 9.697 , P < 0.01) ,而肝細胞膽固醇轉出率(3.27 ±0.65)較對照組(4.77 ±0.33) 明顯降低( t = 11.419 , P <0.01) 。

表2 　兩組6 周后不同組織細胞中ABCA1 表達量的變化(.x ±s ,n = 6)

Tab1 2 　ABCA1 expression in different cells of the two groups af2ter 6 weeks (.x ±s ,n = 6)

對照組            3.64 ±0.37           19.68 ±9.10            21.72 ±4.54          2.35 ±0.32

t 值             7.101               10.081            6.488               9.347

2．4 　兩組不同組織中膽固醇含量的變化　6 周后,煙酸組主動脈、脂肪組織、肝組織中的膽固醇含量(分別為1.30 ±0.08、1.27 ±0.14、0.71 ±0.09mmol/ g)與對照組(分別為1.65 ±0.18、1.89 ±0.11、0.95 ±0.11mmol/g)比較均明顯減少( P< 0.01) 。

2．5 　兩組的AS 病理改變　6 周后,肉眼觀察可見對照組主動脈有明顯粥樣斑塊形成,蘇丹Ⅳ染色陽性區(qū)域明顯,呈鮮紅色息肉狀、不規(guī)則或橢圓形,或呈散在顆粒狀斑點;煙酸組斑塊面積則較對照組顯著減少(圖1) 。對照組主動脈AS 面積占血管內膜總面積的百分比為10108 % ±1166 %,煙酸組為7191 % ±0136 %,兩組差異具有統(tǒng)計學意義( t = 21873 , P = 01035) 。

圖1 　兩組主動脈斑塊蘇丹Ⅳ染色結果

A1 對照組;B1 煙酸組;箭頭示AS 斑塊

Fig1 1 　Aortic plaque stained by Sudan Ⅳin two groups

2．6 　腹腔巨噬細胞ABCA1 表達量與膽固醇轉出率的相關性　對照組、煙酸組腹腔巨噬細胞上ABCA1 表達量與外周單核細胞( r = 0.883 , P = 0.020 ; r = 0.984 , P =0.000) 、脂肪細胞( r = 0.836 , P = 0.038 ; r = 0.950 , P =0.004) 、肝細胞( r = 0.847 , P = 0.033 ; r = 0.971 , P =0.001)的[3 H]膽固醇轉出率均呈正相關。

3 　討　　論

由膽固醇、磷脂與載脂蛋白結合形成的HDL2C 對防止AS 有重要作用。有研究證明,ABCA1 基因缺陷是Tangier 病的病因[5] ,從而使人們認識到ABCA1 具有主動轉運細胞內膽固醇至細胞外的作用。ABCA1是由2261 個氨基酸組成的含有兩個相似結構的膜蛋白,含有兩個跨膜區(qū)和兩個核苷酸結合區(qū)(NBD) [6] 。ABCA1 能介導膽固醇、磷脂及其他脂蛋白外流至細胞膜表面,與貧脂的apoA1 結合后可達到清除細胞內超載的膽固醇、增加RCT 的作用[7] 。

煙酸作為降脂藥物具有獨特的調脂功效,但早期因其具有皮膚潮紅、肝毒性等不良反應而使臨床應用受到了限制。隨后的研究發(fā)現(xiàn),煙酸是目前升高HDL2C效果最好及唯一能降低脂蛋白的藥物,具有全面調脂作用。Birjmohun 等[8] 對煙酸升高HDL2C 的隨機對照試驗進行了薈萃分析,發(fā)現(xiàn)4749 例煙酸治療患者中, TC、TG、LDL2C 分別降低了10 %、20 %、14 %,

HDL2C升高了16 %,主要冠脈事件降低了27 %。此外,煙酸還具有調脂以外的其他抗AS 作用,如延緩斑塊的進展、促進斑塊的逆轉[9] 。體外研究發(fā)現(xiàn),煙酸單獨作用能明顯增加冠心病患者單核細胞中ABCA1 的表達[10] ,且在3T32L1 脂肪細胞中可呈劑量依賴性地增加ABCA1 mRNA 的表達,促進apoA1 介導的膽固醇流出[11] ,并可顯著上調ABCA1 的表達[12] 。

本研究結果顯示,煙酸能降低血漿TC、NHDL2C 水平,升高具有抗AS 作用的HDL2C、apoA1 的水平,使肝細胞上ABCA1 的表達量降低,但可升高肝外組織細胞(單核細胞、巨噬細胞、脂肪細胞) RCT 關鍵基因ABCA1的表達。Jin 等[13] 報道,煙酸能使Hep G2 細胞清HDL2C、apoA1 的能力降低,但并不影響對膽固醇酯的清除。Zhang 等[14]研究發(fā)現(xiàn),煙酸可通過降低ATP 合酶β鏈在Hep G2 細胞膜上的表達,起到升高HDL2C 的作用。由此推測,煙酸降低肝ABCA1 表達量后可能使肝細胞清除HDL2C、apo2A1 的能力降低,這可能是HDL2C升高的原因之一。Singaraja 等[15]報道,肝臟及外周AB2CA1 在RCT 中具有不同作用,但煙酸對肝ABCA1 表達量的影響在AS 進程中的作用尚需進一步研究。

本研究還證實煙酸能減少AS 面積及主動脈、脂肪組織、肝組織中的膽固醇含量。腹腔巨噬細胞上ABCA1 的表達量與外周單核細胞、脂肪細胞、肝細胞的[3 H]膽固醇轉出率呈明顯的正相關,能較準確地反映體內膽固醇代謝情況,是較好的檢測指標。因此,煙酸是通過上調外周細胞(單核細胞、巨噬細胞、脂肪細胞)上ABCA1 的表達量,使外周細胞中膽固醇轉出率

增加,提高RCT 的起始步驟來發(fā)揮其抗AS 及心血管保護作用的,但煙酸降低肝細胞ABCA1 表達的意義尚需進一步研究。

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